Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) — это метод, позволяющий выявлять генетические аномалии у плода с высокой точностью и без риска для матери и ребенка. В основе НИПТ лежит анализ фетальной ДНК, которая циркулирует в плазме крови матери. Давайте разберемся, какие этапы проходят образцы в лаборатории, прежде чем становятся частью заключения, которое получает пациент.

Процедура

Первый шаг — это забор венозной крови у будущей мамы. Процедура стандартная и не отличается от обычного анализа крови. Для теста достаточно 10-20 мл крови, которые собираются в специальные пробирки. Эти пробирки содержат стабилизаторы форменных элементов крови, которые защищают свободно-циркулирующую ДНК и обеспечивают её сохранность.

Подготовка и транспортировка

Важно, чтобы образцы крови хранились и транспортировались при определенных условиях. Пробирки помещают в холодильник, где они хранятся при температуре от +4 до +8°C. Кровь нужно доставить в лабораторию в течение 4-5 дней с гелевыми хладоэлементами, поддерживающими температуру от +4 до +8°C. Если условия транспортировки нарушаются, качество ДНК может ухудшиться, и тест станет менее точным.

2. Выделение ДНК

Центрифугирование

Следующий этап — отделение плазмы крови от форменных элементов. Чтобы отделить плазму от других компонентов крови, образец центрифугируют, то есть быстро вращают. В результате плазма, содержащая свободно-циркулирующую ДНК, отделяется от клеток крови.

Экстракция ДНК

Затем плазму подвергают выделению ДНК. Процесс включает в себя лизирование, с последующей отмывкой ДНК от продуктов распада белков и клеток при помощи магнитных частиц.

Оценка качества и количества

После выделения ДНК производится оценка ее концентрации. Для этого используется специальный прибор флуориметр. Если концентрация ДНК низкая, производится повторное выделение из оставшейся в хранении плазмы.

3. Подготовка библиотек NGS и секвенирование

Выделенная ДНК помещается в роботизированную станцию приготовления библиотек NGS, в ходе работы которой каждый образец соединяется с уникальной последовательностью — баркодом, амплифицируется (многократно копируется) с праймерами, равномерно покрывающими весь геном и, финально, отмывается от продуктов ПЦР. После завершения работы станции образцы загружаются в секвенатор и запускается процесс секвенирования.

Секвенирование нового поколения (NGS - next generation sequencing) позволяет многократно «прочитать» последовательности ДНК, что необходимо для выявления возможных генетических отклонений. В некоторых случаях также может применяться количественная ПЦР (qPCR), но NGS дает более точные результаты, особенно когда нужно проанализировать большой объем данных.

В процессе секвенирования определяется точная последовательность нуклеотидов в каждом фрагменте и разделение образцов по соответствующим баркодам. Полученные данные представляют собой массивы информации, которые требуют дальнейшей обработки.

4. Биоинформатический анализ данных

Разделение данных

После получения данных начинается их обработка. Сначала необходимо отделить ДНК плода от материнской ДНК, которая тоже присутствует в плазме крови. Для этого используются биоинформатические алгоритмы, которые распознают и отцифровывают фрагменты фетальной ДНК. Этот этап важен, так как от него зависит точность последующего анализа.

Фильтрация

После того как ДНК плода выделена, данные нужно очистить от возможных ошибок, которые могли возникнуть в процессе секвенирования. Это делают с помощью алгоритмов, которые устраняют погрешности и артефакты. Результатом становится набор данных, в котором осталась только полезная информация.

Качество данных

Качество данных проверяют по нескольким критериям: процентное отношение фетальной ДНК и ДНК матери (фетальная фракция), ширина покрытия генома, количество ошибок прочтения и полученных фрагментов. Если качество данных недостаточно, тест могут порекомендовать повторить.
Сравнительный анализ
После выделения фетальной фракции, проводится выравнивание на референсный геном. Это позволяет обнаружить возможные хромосомные аномалии, такие как синдром Дауна. Выравнивание выполняется с помощью статистических методов, которые рассчитывают вероятность наличия той или иной генетической патологии.

5. Интерпретация данных

Моделирование и прогнозирование

Полученные данные анализируются с использованием статистических моделей, которые оценивают вероятность наличия хромосомных аномалий. Результаты представляют в виде числового значения - Z-score по исследуемым хромосомам. При превышении Z-score пороговых значений, выносится заключение о повышенном риске хромосомной аномалии.

Формирование заключения

Последний этап — это формирование заключения, которое включает в себя результаты анализа и их интерпретацию. Заключение оформляется так, чтобы оно было понятно как врачам, так и будущим родителям. В нем также содержатся рекомендации по дальнейшим действиям в зависимости от полученных результатов.

Лабораторные этапы НИПТ — это сложный и многоступенчатый процесс, требующий внимания к деталям и соблюдения всех стандартных процедур. От правильного забора и обработки образцов до анализа и интерпретации данных — каждый этап играет роль в обеспечении точности теста. Это позволяет сделать НИПТ надежным инструментом для диагностики генетических аномалий, который помогает будущим родителям и врачам принимать обоснованные решения по ведению беременности.